在进行RNA提取时,应注意以下几点:
防止外源RNA酶污染
使用RNAase-free的工具和试剂,确保实验环境干净,避免与其他实验室工作同时进行以减少污染风险。
操作人员应佩戴口罩和手套,使用一次性无菌器具,并对实验台面及周围环境进行灭酶处理。
防止内源RNA酶活性
样品细胞或组织在提取前应进行适当的处理,如使用液氮速冻,以降低内源RNA酶的活性。
在提取液中加入RNA酶抑制剂,如异硫氰酸肽(GTC)、β巯基乙醇、盐酸胍、尿素和去污剂(如十二烷酰肌氨酸钠、SDS)。
有效破碎细胞
根据样本性质选择合适的细胞破碎方法,如机械法、化学法或酶解法,避免过度破碎导致RNA降解。
RNA的纯化
使用氯仿等有机溶剂分离RNA与DNA和蛋白质,注意密闭操作和局部排风,避免直接接触。
采用低温沉淀方法,延长沉淀时间以提高RNA浓度和纯度。
试剂和仪器的消毒
玻璃器皿和金属器具需用DEPC水或无酶产品处理,确保无酶残留。
所用试剂也应进行专门的消毒灭酶处理。
操作细节
整个提取过程应在冰上进行,避免高温高压,以减少RNA酶的活性。
操作过程中避免使用可能含有RNA酶的器具,如未彻底消毒的移液器和离心管。
质量控制
提取完成后,应对RNA进行质量检测,如比浊度测定、凝胶电泳和荧光分析,确保RNA的完整性、纯净度及无降解。
样本的收集与保存
样本的收集和保存非常重要,应使用RNAase-free工具,并立即将样本冷冻保存在液氮中,防止RNA降解。
通过遵循以上注意事项,可以有效提高RNA提取的质量和成功率,确保后续实验的可靠性。