检测细胞凋亡有多种方法,以下是一些常用的指标和方法:
PI和Annexin-V双标法
原理:磷脂酰丝氨酸(PS)在细胞凋亡早期从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面,Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,能结合到暴露的PS上。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料,不能透过活细胞膜,但能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞膜,使细胞核染成红色。将Annexin V和PI一起使用,可以将凋亡早期、晚期的细胞以及死细胞区分开来。
电镜检查
原理:通过透射电子显微镜观察凋亡细胞的形态变化,如细胞体积变小、细胞质浓缩、染色质凝聚、核膜不破裂、细胞核分裂和凋亡小体形成等。电镜检查是鉴定凋亡的金标准,但其劣势在于操作繁琐且设备昂贵。
细胞核染色
方法:使用Hoechst和DAPI等荧光染料对细胞核进行染色,观察细胞核形态的变化。Hoechst 33258和Hoechst 33342是常用的染料,前者渗透性较差,多用于活细胞染色,后者活细胞和死细胞均可。通过荧光显微镜拍照,可以观察到细胞核的形态变化,如染色质凝聚、边缘化等。
TUNEL法
原理:末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将带有荧光素标记的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)添加到DNA断裂的末端,通过荧光显微镜检测荧光标记的DNA缺口,从而判断细胞凋亡。
流式细胞术
原理:利用Annexin V和PI或其他染料对细胞进行双染色,通过流式细胞仪检测细胞表面磷脂酰丝氨酸的外翻和细胞的DNA含量变化,从而区分活细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞。
基因表达检测
方法:检测凋亡相关基因(如Fas、Bcl-2、bcl-X等)的表达水平,常用Northern杂交、RT-PCR和荧光定量PCR等技术。这些方法通过检测特定基因的mRNA或蛋白质表达水平来判断细胞凋亡的状态。
这些方法各有优缺点,选择哪种方法取决于实验的具体需求和条件。例如,如果需要快速、大量地检测细胞凋亡,流式细胞术是一个高效的选择;如果需要观察细胞形态变化,电镜检查或光学显微镜是更好的选择;如果关注基因表达水平的变化,基因表达检测方法更为适用。