在T载体连接中，通常使用的酶是 T4噬菌体DNA连接酶。T4噬菌体DNA连接酶能够在有Mg2+和ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的T载体分子与外源DNA分子进行连接。它不仅可以连接两个带有相同粘性末端的DNA分子，还能连接两个平末端的双链DNA分子，这是大肠杆菌DNA连接酶所不具备的特性。
材料准备
T载体（如pUCm-T）
T4 DNA连接酶（如TAKARA，350U/ul）
连接酶缓冲液（如10x buffer）
无菌ddH2O
旋涡混合器
微量移液取样器
移液器吸头
1.5ml微量离心管
双面离心管架
台式离心机
干式恒温气浴
操作步骤
将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°C。
取4个灭菌的200ul微量离心管，加入以下成分：
4ml目的基因
1ml T载体
0.5ml T4 DNA连接酶（TAKARA，350U/ul）
1ml连接酶缓冲液
3.5ml无菌ddH2O
总量10ml体系
轻轻震荡混合液，然后短暂离心，置于14°C干式恒温仪（或14°C水中）中保温过夜（12-16小时）。
连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
这种连接方法通常用于将PCR产物克隆到T载体中，形成含有目的基因的重组载体。通过在PCR产物的两端添加一个突出的A碱基，可以与T载体的3’端T碱基进行配对，从而在T4连接酶的催化下实现连接。
建议
选择合适的连接酶：根据具体实验需求选择T4噬菌体DNA连接酶或大肠杆菌DNA连接酶。T4连接酶在连接平末端DNA时效率更高，而大肠杆菌连接酶在连接粘性末端时更为常用。
优化连接条件：连接温度、时间和缓冲液成分都会影响连接效率。通常在12-16℃下进行连接，以保持短暂配对结构的稳定性，同时最大限度发挥连接酶的活性。
避免自环：在连接前对载体进行5’除磷酸处理，可以防止载体自环，提高连接效率。
通过以上步骤和注意事项，可以有效地进行T载体的连接，为基因工程实验提供可靠的重组载体。